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固定酶底物法测定水中粪大肠菌群的优点及影响
添加时间:2018-08-17
  摘要:使用酶底物法和多管发酵法检测水质中的粪大肠菌群,结果表明,两种方法在统计学上并无显著差异。酶底物法具有操作快速简便的优点,检测灵敏度也高于多管发酵法。酶底物法可以采用成品的培养基及试剂,操作方便,无需确认验证,20h即可判断水样中粪大肠菌群的MPN值,实验环境是否无菌对酶底物法测定水中粪大肠菌群的影响不大,但是培养温度对结果影响较大。
粪大肠菌群主要来粪便,它在44-44.5℃的高温条件下仍可生长繁殖并发酵乳糖产酸产气,其他特性均与总大肠菌群相同。因此,可用提高培养温度的方法造成不利于自然环境的大肠菌群生长的条件,使培养出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群,从而更准确地反映水质受粪便污染的情况。粪大肠菌群细菌在卫生学上具有重要的意义。
目前水中粪大肠杆菌群(耐热大肠菌群)的检测方法主要有传统的多管发酵法和滤膜法,并且已经列入环保行业标准方法,此两种传统方法被国内环境检测部门广泛采用。传统方法实验操作需要较多的试剂盒器材,步骤繁琐,检验周期较长,培养基保存时间短,阳性结果需验证试验,对实验室环境的无菌程度要求也比较高,不能对谁的温升学状况作出快速的评价,制约了其应用。
固定底酶底物法利用大肠菌群细菌能产生β-半乳糖苷酶(β-D galactopyranoside)使培养液呈黄色,来判断水样中是否含有大肠菌群、粪大肠菌群(耐热大肠菌群)。目前被美国、欧洲及大部分亚洲国家广泛应用于水中总大肠杆菌,粪大肠菌群(耐热大肠菌群)及大肠埃希氏菌的检测,并通过美国RPA、《水与废水标准检测方法》认证。
本文通过比对试验,证实了酶底物法和多管发酵法在统计学结果上无显著差异,并对影响酶底物法实验进行了研究。
1.实验部分
材料与试剂
乳糖蛋白胨和EC肉汤培养基;高温压力灭菌器;3mm接种环;立科试剂;标准菌株大肠埃希氏菌,MPN值/100mL标准值341/100mL,可接受范围34~703/100mL无菌取样瓶(里面装有1.5%硫代硫酸钠去除水样中的余氯);97孔定量盘;封口机(带97孔定量盘橡胶拖垫);97孔阳标准比色盘;培养箱。
1.2样品来源
巢湖入湖口水源水,某污水处理厂出水,某固废处理厂出水。
1.3实验方法
1.3.1多管发酵法
参考《GB/T5750. 12-2006 生活饮用水标准检验方法》和《HJ/T 347-2007 水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法》具体操作步骤见表1.
酶底物法
具体操作方法详见表1.
 

多管发酵法

酶底物法

培养时间 48h 24h
准备物品  乳糖蛋白胨培养基,EC培养基、试管、移液管、接种棒、以及其他常规实验室仪器 立科试剂,定量盘,封口机
实验室环境 实验环境 培养基和器材均需灭菌 ,操作应在无菌室或无菌操作台进行 试剂和器材都是一次性无菌的成品,操作可在非无菌环境中进行
操作步骤 初发酵:将待测试水样用3个不同水样量接种,每个水样量要有5个管。其中,如接种体积为10mL或少于1mL,则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液中。
培养:接种后的水样置于37±0.5℃培养24h
复发酵:初发酵阳性结果的发酵管,用接种棒将培养物转接到EC培养液中,于44.5±0.5℃培养24h
于100mL水样中加入一份立科试剂,充分混匀,混合后倒入水样在定量盘中用配套封口装置封装,于44.5±0.5℃培养24h
操作时长
最低检出个数 2个/100ml 1个/100ml

2 结果
2.1 实验数据的可行度评价
采用大肠菌群质控样品大肠埃希氏菌来自国家标准菌库,用无菌水稀释到一定倍数,分别用酶底物法和多管发酵法培养,查MPN表得出结果。如表2所示,两种方法的测定结果均在质控范围内,经配对t检验分析,两者差异无统计学意义,t=0.63,p>0.05。

两种方法的比对分析
采用多管发酵法和酶底物法同时测定巢湖入口湖口。
表1 多管发酵法、酶底物法测定水中粪大肠菌群方法的比较
实验环境对酶底物法分析结果的影响
在同一个点位采样8份,用酶底物法分别在无菌操作间、非无菌实验室、室外环境中进行检测,分析结果如图3所示。将非无菌室和室外检测的结果分别与无菌室中检测的结果进行配对t检验分析,t值分别为0.57和0.91,p>0.05.因此,酶底物法与实验环境是否无菌关系不大。
培养温度对酶底物法分析结果的影响
在8个不同的点位采集水样,用酶底物法在40-49℃进行培养,结果如表3.将44℃和45℃两组数据无显著性差异。但是40℃、42℃、47℃和49℃的培养结果与44℃相比,均有显著性差异(p<0.05)。
粪大肠菌群的最佳培养温度为44.5±0.5℃。如果培养温度过低,除了粪大肠菌群之外的其他大肠菌群会有部分继续生长,从而导致结果偏高。而培养温度过高,粪大肠菌群会停止生长,导致结果偏低。因此,酶底物法分析大肠菌群需严格控制培养温度。
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